比较基因组分析

1. 基因家族聚类

基因家族是来源于同一个祖先，由一个基因通过基因重复和物种分歧而产生两个或更多的拷贝而构成的一组基因，它们在结构和功能上具有明显的相似性，编码相似的蛋白质产物，同一家族基因可以紧密排列在一起，形成一个基因簇，但多数时候，它们是分散在同一染色体的不同位置，或者存在于不同的染色体上的，各自具有不同的表达调控模式。基因家族的鉴定，是进化分析很重要的一个方面; OrthoMCL(http://orthomcl.org/orthomcl/)流程是较常用的基因家族鉴定流程。

Step1：对各个物种的基因集进行过滤。首先，一个基因存在多个可变剪接转录本时，仅留取编码区最长的转录本用于进一步分析；其次，将编码蛋白质小于50个氨基酸的基因排除。

Step2：通过blastp比对获得所有物种蛋白序列之间的相似性关系；e值为1e-5；再用solar连接断开片段；

Step3：使用OrthoMCL软件对比对结果进行聚类，膨胀系数使用1.5；通过这个分析，可以得到单拷贝基因家族和多拷贝基因家族，它们在物种之间都是比较保守的；还可以得到物种特有的基因家族，它们可能与物种的特异性有关;

Step4: 用muscle进行多序列比对，并对结果进行处理（一个位点上若只有一个物种含有碱基，这种情况删除这个位点），同时并进行格式转化（每个物种为一行，物种名称在前，序列在后的格式，每个物种碱基位点一一对其）

通过这个分析，可以得到单拷贝基因家族和多拷贝基因家族，它们在物种之间都是比较保守的；还可以得到物种特有的基因家族，它们可能与物种的特异性有关；

2. 系统进化分析

在基因家族聚类的Step4中，利用单拷贝基因家族的序列，对各个家族进行MUSCLE (http://www.drive5.com/muscle/)比对，之后将比对结果合并，形成一个super alignment matrix，然后使用RAxML(http://sco.h-its.org/exelixis/web/software/raxml/index.html)软件利用极大似然法（ML TREE）对所分析的物种进行系统发育树的构建；

3. 物种分歧时间的估算

用单拷贝基因家族，使用PAML软件包中的mcmctree (http://abacus.gene.ucl.ac.uk/software/paml.html)进行分歧时间估计，利用timetree网站，文献中的分歧时间和r8s得到的时间校正点进行校正，TimeTree(http://www.timetree.org/)网站以及相关文章，mcmctree的运行参数为：burn-in=10,000，sample-number=100,000，sample-frequency=2；

3.1 运行r8s得到一部分矫正点

3.2 查阅相关文献检结合timetree和r8s的结果，使用mcmctree进行分歧时间的估算

4. 基因家族的扩张与收缩

根据基因家族的聚类分析结果，并过滤基因数在个别物种中存在异常的基因家族，使用CAFÉ(http://sourceforge.net/projects/cafehahnlab/)软件进行基因家族扩张和收缩分析；进行扩张收缩分析之前，过滤掉在物种之前数目变化太大的基因家族，比如有一个基因家族的基因数目超过了200，此基因家族在所有的物种中数目小于2的

5. 正选择分析

通过MUSCLE软件对物种中的单拷贝基因家族的蛋白质序列进行多序列比对，比对结果通过Gblocks (http://molevol.cmima.csic.es/castresana/Gblocks.html)软件进行过滤，去除低质量的比对区域，剩余比对结果作为模板生成对应的CDS多序列比对结果。对每个基因家族，使用PAML软件包中的codeml工具，选择枝位点特异模型（branch-site model）检测秋茄基因家族是否受到正选择。在PAML中，正选择通过两种假设的似然比检验来确定是否存在正选择情况而非简单的寻找ka/ks>1的基因。

6. 全基因组复制事件(WGD)

利用MCscan(http://chibba.agtec.uga.edu/duplication/mcscan/)软件，分别搜索基因组内部及近缘物种基因组间的共线性区段，对该基因组内（间）共线性区段所包含的重复基因对进行序列比对，并计算4dTV值。4dTV可反映物种在进化史中是否发生全基因组复制事件、以及通过它与其它植物分化时间的比较区分发生全基因组复制相对时间的早晚，可判断两物种分化的时间，峰值为对应物种发生全基因组复制或分歧时间点。物种自身比较用的是旁系同源基因，物种与近缘物种的比较使用的是直系同源基因