.8.26丨Nanopore甲基化测序产品概述

时间:2024-02-20 19:33:35
  • 一、Nanopore甲基化
    • 基本概念
      • 甲基化属于表观遗传
      • 遗传学: 基于基因序列改变所致基因表达水平变化,如基因突变、基因杂合丢失和微卫星(SSR) 等
      • 表观遗传学: 指基于非基因序列改变所致基因表达水平变化,如DNA甲基化和染色质构象变化等
      • 表观遗传现象:DNA甲基化(去甲基化)、基因组印记、休眠转座子**、母体效应、基因沉默、核仁显性、RNA编辑等
      • 表观遗传学的常见机制
        • DNA 甲基化:化学修饰的一种形式,能在不改变DNA序列的前提下,改变遗传表现; l 组蛋白修饰
        • DNA去甲基化:组蛋白修饰:甲基化、乙酰化、磷酸化、腺苷酸化、泛素化、ADP 核糖基化
        • 染色质可接近性:经染色质重塑后呈现出松散的状态,被称为开放染色质或可接近性染色质 (ATAC-Seq)
        • 非编码RNA调控
        • 蛋白-DNA互作
    • DNA甲基化类型

      • 5-甲基胞嘧啶(5-mC)
        • 基本概念:甲基化C碱基在基因组上的分布包含三种形式(CG, CHG和 CHH,其中H代表A 或T或C碱基)
        • 特点
          • 植物甲基化多发生于CpG、CHG、CHH
          • 哺乳动物甲基化多发生于CpG二核苷酸序列上
          • CpG富集区域多位于基因的启动子区域
          • 位于启动子区域的甲基化一般会抑制转录
        • 作用方式
          • 抑制转录因子的结合, 从而抑制转录过程
          • 结合抑制因子, 从而抑制转录过程 
        • 不同物种甲基化水平
          • 植物中,三种甲基化类型均存在
          • 动物以CpG为主
          • 甲基化具有一定保守性
      • N6-甲基腺嘌呤(N6-mA)
        • 真核生物中,最常见的甲基化修饰是5-甲基胞嘧啶 胞嘧啶(5mC)
        • 原核生物中,N6-甲基腺嘌呤(6mA,或m6A)是 最普遍的DNA修饰
        • 真核生物表达丰度特别低,尤其是在哺乳动物,每 百万个腺嘌呤中大概只有不到10个位点是6mA
        • 联川做得比较好
        • 特征分布
          • DNA 水平的6mA检测研究物种: 莱茵衣藻、秀丽隐杆线虫、果蝇,蛙,小鼠、人、斑马鱼、猪和水稻等真核物种
          • 6mA位点富集在转录起始位点(TSS),如莱茵衣 藻
          • 基因组上广泛分布,如秀丽隐杆线虫,水稻
          • TSS位点6mA稀缺,如蛙和小鼠
          • 6mA在重复序列区富集,如果蝇,斑马鱼和小鼠 u 斑马鱼基因组的52.2%是重复序列,而其77%以上 的6mA峰分布落在重复序列区
        • 生物学功能
          • 可能参与基因的转录
            • 莱茵衣藻,TSS附近富集6mA标记,且转录活性和甲基化状态呈现正相关
            • 果蝇中,DMAD介导的去6mA甲基,导致6mA附近的基因或者转座子表达受到抑制,6mA可能介导了 基因或者转座子的活化表达
            • 小鼠的胚胎干细胞(mESC)中,6mA抑制了转座子和邻近基因的表达
            • 6mA与热胁迫关键基因的表达呈正相关
          • 可能参与核小体的定位
            • 莱茵衣藻中, 6mA通常位于核小体之间的linker DNA上,越远离TSS位点,6mA就变得越稀疏有可能是 6mA调节着核小体的定位
          • 可能作为一种表观Marker
            • 斑马鱼胚胎发育的早期,5mC处于去甲基化的状态,而6mA却处于丰 度激增的状态, 此时的6mA可能作为一种补充性的表观marker,控制 着基因的转录表达
          • 销售建议,将5-mC与6-mA一起做,进行联合分析,鉴定同一时期,不同甲基化的关系
      • *7-甲基鸟嘌呤(7-mG) (略)
      • m6A
        • 基本概念
          • RNA甲基化修饰占所有RNA修饰的60%以上, 而m6A是高等生物mRNA和lncRNA上最为 普通的修饰
          • 在RNA层面,哺乳动物的m6A修饰的比例为 0.1-0.4%,平均每条mRNA有3-5个m6A位点
          • 目前miRNA、circRNA、rRNA、tRNA和 snoRNA都可发生m6A修饰
        • 特点:
          • 主要存在于 DRACH 的基序上(D = A/G/U; R = A/G; H = A/C/U)
          • 出现位置存在富集现象:特别是在终止密码子周围、3\'非翻译区(3\'-UTR)和编码序列(CDS),少数出现在 起始密码子附近,内含子很少
          • 人和小鼠 m6A 位置高度保守
        • 作用方式:
          • 5\'端甲基化修饰,主要功能为维持mRNA稳定性、mRNA前体剪切、多腺苷酸化、mRNA运输与翻 译起始等
          • 3\'端 polyA修饰有助于出核转运、翻译起始及结合蛋白维持mRNA结构稳定
        • 技术手段:
          • 比色法
          • 液相色谱质谱联用(LC-MS)
          • MeRIP-seq:抗体富集,m6A高甲基化区域
          • miCLIP-seq:抗体富集,紫外交联,单碱基水平
    • 销售建议:
      • DNA甲基化产品
        • 5mC
          • 传统:全基因组甲基化测序WGBS
          • 简化甲基化测序RRBS
          • 甲基化DNA免疫共沉淀测序MeDIP-Seq
        • 6mA
          • 传统:基于免疫沉淀法(6mA-IP)
          • 限制酶切法(6mA-RE-seq)
          • LC-MS/MS法 三代单分子测序法(Pacbio)
        • 产品核心竞争力:ONT检测平台可以同时检测5mC与6mA
        • 缺陷:
          • 价格稍贵——甲基化客户一般经费充足
      • 除非有6mA研究经验,否则不建议向客户推荐。目前产品尚不清楚是否已研发完成
  • 二、ONT甲基化平台
    • 建库流程
      • 提取高质量基因组 DNA,利用Nanodrop、Qubit 和 0.35% 琼脂糖凝胶电泳进行 纯度、浓度和完整性质检;
      • 利用gTube将基因组DNA打断成平均8kb左右;
      • 文库构建(官方试剂盒):
        • DNA 损伤修复和末端修复,磁珠纯化;
        • 接头连接,磁珠纯化;
        • Qubit 文库定量。
      • 上机测序
    • ONT甲基化分析流程
      • Guppy软件进行 basecall
      • Nanopolish 检测 CpG
      • tombo检测CHH (H=A/T/C), CHG和6mA 位点
    • ONT平台优势
      • 单碱基水平检测,无中间处理(重亚硫酸盐), 不扩增(NGS测序)、不富集(抗体或酶切), 真实还原碱基修饰信息
      • 测序读长长(8kb文库),避免短读长带来的拼 接比对错误,鉴定准确 u 相同测序深度,鉴定到的甲基化位点数更多,一 致性占比高(0.97以上)
      • 鉴定种类丰富(5mC & 6mA),多种碱基修饰一 次搞定,数据具有可比性,性价比高(6mA市场 价1W左右)
    • 应用方向
      • 多组学联合

        • 植物上特有小RNA与DNA甲基化调控
      • 发育调控

        • DNA甲基化一般并不单独起转录调控作用,与其他组学共同调控;
        • DNA甲基化最稳定(不易变化)的调控方式;
        • 不能仅仅关注启动子区,不能仅仅关注单一组学
      • 胁迫
      • 其他(基因印记、基因沉默)
      • 疾病研究
    • 生物学重复(3个)
    • 环境应答与表现修饰
      • 鉴定表型后再取样
      • 行为学结果支持也可以测样
    • 案例(略)
    • 产品类型
      • 二代:WGBS 30X
      • 三代:Nanopore 30X
    • 送样要求
      • DNA总量:
        • 单次建库2ug以上
        • 多次建库4.5ug以上
      • 纯度要求
        • a) OD260/280 在 1.7-2.2 之间;OD260/230 在 1.7-2.3 之间;
        • b) Nanodrop/Qubit 比值 0.8-2.5; 检测峰图正常;
        • c) 澄清无色, 无不可溶解物质;溶液中不含去污剂、 表面活性剂、 变性剂, 螯合剂和高浓度 的盐;
        • d) 无单链 DNA、 RNA、 蛋白质或染料污染。
      • 长度要求
        • a) 平均片段大小: PFGE 或低浓度琼脂糖(0.3%) 检测, >30kb;
        • b) 避免高速涡旋振荡等剧烈方式处理基因组 DNA, 如需混匀, 使用宽口径枪头轻柔吹洗或 颠倒轻叩样本管;
        • c) 切忌反复冻融