Title:
Multiclonal Invasion in Breast Tumors Identified by Topographic Single Cell Sequencing
课题的目的和意义:
Ductal carcinoma in situ (DCIS,原位导管癌)是一种早期的乳腺癌,很少发展成invasive ductal carcinoma(IDC,浸润型导管癌).由于瘤内异质性和导管中肿瘤细胞数量低，因此很难刻画在侵袭期间的基因组进化过程。为了克服这个障碍,作者开发了Topographic(地形图的) Single Cell Sequencing方法,测量单个肿瘤细胞的基因组拷贝数谱，同时保留其在组织切片中的空间背景.
作者将该方法应用在10例同时具有DCIS和IDC区域的患者,包含了1,293个细胞.作者发现DCIS和IDC之间不仅有着直接的基因组谱系,并且在IDC中的亚克隆群体显示大多数突变和拷贝数畸变在入侵前就已经在管道内发生了。
作者认为得到的结果支持多克隆入侵模型，其中一个或多个克隆逃离导管并迁移到邻近组织中以建立侵袭性癌。
研究背景:
1) DCIS是最常见的早期乳腺癌通常routine mammography(常规乳房摄影)就可以发现,其中只有一小部分(10%–30%)的病例会发展成IDC
2) 关于癌症的浸润侵袭,已经建立了很多模型:
A) independent lineage model
支持该模型的认为原位肿瘤和侵袭肿瘤是平行进化并且在基因组的畸变上没有共通之处
B) evolutionary bottleneck model
支持该模型的认为有多个克隆在导管内进化，之后单个克隆逃脱基底膜并扩展形成侵袭性肿瘤块
C) muticlonal invasion
支持该模型的认为有多个克隆在导管内进化，之后有多个克隆逃脱基底膜并扩展形成侵袭性肿瘤块
3) Single-cell DNA sequencing已经成了一项重要的工具用于解决肿瘤内异质性,描绘基质细胞类型(肿瘤微环境)以及发现稀有亚克隆.
4) 细胞分离手段是制约单细胞测序技术的一大因素,现有的方法有:
a) Fluorescence-activated cell sorting (FACS)
根据荧光标记将一个细胞群分为多个亚群,根据所染荧光团的类型，可将荧光团偶联抗体染色细胞彼此分离
b) Micromanipulation(显微)
利用显微操作仪进行细胞分离
c) Microdroplets(微滴)
在微流体通道内以小水滴进行实验，相互之间通过连续的油相分离。
d) Nanowells(纳米孔)
荧光标记的细胞加入到制造的纳米孔中并使用高速落射荧光显微镜成像
以上制备细胞悬液方法都失去了其空间位置信息,而组织病理学信息在研究侵袭型肿瘤时是至关重要的
5) 作者为了克服这个限制,设计了新的单细胞测序方法Topographic Single Cell Sequencing,结合Laser-catapulting(激光弹射)测定癌细胞的体细胞拷贝数谱同时保留其在组织中的空间位置信息.
拷贝数流程:
10对来自乳腺癌病人的同步DCIS-IDC以及癌旁邻近组织取自UT MD Anderson Cancer Center Breast Tissue Bank.病人的年龄在36-77,IHC定义的ER及 PR status of < 1%,FISH分析得到的Her2/CEP17 < 2.2
1) 冷冻组织切片染色及组织扫描
H&E (Haematoxylin and Eosin)是两种染色剂,在收集待测序的细胞之前，使用PALM MicroBeam上的AxioCam iCC 1以10倍放大率扫描组织切片。扫描切片是为了成像以后方便后面的激光分离细胞.
2) 利用激光弹射分离单细胞
经过前面的组织扫描以后,通过组织病理学特征(大小,形状,和最近导管的距离)分类出原位和浸润的导管癌细胞.然后利用激光弹射将单细胞分离下来,分离前后的对比是为了确定仪器的参数设置.
3) 收集并存放单细胞
利用Laser-catapulting transfer将激光弹射得到的细胞每个都单独的存放在一个tube中.
4) 单细胞基因组扩增
将单细胞扩增到96个副本，然后使用Degenerative-Oligonucleotide-Primer PCR (DOP-PCR)进行全基因组扩增.
为了保证质量,通过电泳确定WGA DNA片段的大小分布，只保留大于300bp片段大小的样品并纯化.
5) 全基因组测序
用 HiSeq4000 system进行全基因组测序
6) 图像数据处理
确定每个单细胞的明场图像和xy轴位置,为了定位组织位置
7) 处理拷贝数变异数据
A) bcl2fastq将BCL(base call)文件转换到FASTQ文件
B) 用Bowtie 2 (2.1.0)将FASTAQ文件映射到hg19参考基因组 ,得到BAM文件
C) SAMtools (0.1.16)对得到的BAM文件排序
D) 使用SAMtools标记并去除PCR重复物
E) 经过‘variable binning’ pipeline处理后得到read count
F) 使用circular binary segmentation (CBS) method
{R Bioconductor ‘DNAcopy’ package} 得到segmented mean
[alpha = 0.0001,undo.prune = 0.05]
G) 用{dbscan}进行技术性噪音检测,过滤其中噪音过大的单细 胞
‘variable binning’ pipeline
